Distribuição e conservação dos genes que codificam as proteínas VgrG e Hcp em espécies de Aeromonas

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo

Hardware paralelo reconfigurável para identificação de alinhamentos de sequências de DNA.

Amostras de DNA são encontradas em fragmentos, obtidos em vestígios de uma cena de crime, ou coletados de amostras de cabelo ou sangue, para testes genéticos ou de paternidade. Para identificar se esse fragmento pertence ou não a uma sequência de DNA, é necessário compará-los com uma sequência determinada, que pode estar armazenada em um banco de dados para, por exemplo, apontar um suspeito. Para tal, é preciso uma ferramenta eficiente para realizar o alinhamento da sequência de DNA encontrada com a armazenada no banco de dados. O alinhamento de sequências de DNA, em inglês DNA matching, é o campo da bioinformática que tenta entender a relação entre as sequências genéticas e suas relações funcionais e parentais. Essa tarefa é frequentemente realizada através de softwares que varrem clusters de base de dados, demandando alto poder computacional, o que encarece o custo de um projeto de alinhamento de sequências de DNA. Esta dissertação apresenta uma arquitetura de hardware paralela, para o algoritmo BLAST, que permite o alinhamento de um par de sequências de DNA. O algoritmo BLAST é um método heurístico e atualmente é o mais rápido. A estratégia do BLAST é dividir as sequências originais em subsequências menores de tamanho w. Após realizar as comparações nessas pequenas subsequências, as etapas do BLAST analisam apenas as subsequências que forem idênticas. Com isso, o algoritmo diminui o número de testes e combinações necessárias para realizar o alinhamento. Para cada sequência idêntica há três etapas, a serem realizadas pelo algoritmo: semeadura, extensão e avaliação. A solução proposta se inspira nas características do algoritmo para implementar um hardware totalmente paralelo e com pipeline entre as etapas básicas do BLAST. A arquitetura de hardware proposta foi implementada em FPGA e os resultados obtidos mostram a comparação entre área ocupada, número de ciclos e máxima frequência de operação permitida, em função dos parâmetros de alinhamento. O resultado é uma arquitetura de hardware em lógica reconfigurável, escalável, eficiente e de baixo custo, capaz de alinhar pares de sequências utilizando o algoritmo BLAST.

Estudo toxicológico de extratos do coral alcionáceo Chromonephthea braziliensis (Alcyonacea, Nephtheidae)

Os recifes de corais são ecossistemas diversos com alta densidade de biodiversidade, o que leva a intensa competição entre as espécies. Estas espécies podem produzir substâncias desconhecidas, muitas com valor farmacológico. Chromonephthea braziliensis é um coral mole invasor, originário do Oceano Indo-Pacífico, que foi possivelmente transportado por plataformas de petróleo e cuja presença é uma ameaça para a biodiversidade da região de Arraial do Cabo (RJ). Esta espécie produz metabólitos secundários que são responsáveis pela indução de danos para o ecossistema local. A finalidade deste estudo é a busca de novas substâncias para quimioterapia geral com base na estrutura de compostos bioativos. Extratos desse coral foram preparados a partir de colônias liofilizadas (solventes: hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol). Realizaram-se análises químicas para a caracterização dos extratos e avaliaram-se as atividades: mutagênicas e citotóxicas, usando o ensaio de mutação reversa bacteriana (Salmonella/microssoma) com as linhagens TA97, TA98, TA100 e TA102; genotóxicas, utilizando análise da quebra do DNA e formação de micronúcleos na linhagem RAW 264,7 de macrófagos e; tóxicas para náuplios de microcrustáceos Artemia salina. Observou-se citotoxicidade, na presença de S9 mix, dos extratos diclorometano para a linhagem TA102 na concentração de 20 g/100 L/placa e metanol para a TA97 com 5 e 20 g/100 L/placa. Os extratos diclorometano, acetato de etila e metanol apresentaram genotoxicidade no DNA plasmidial em concentrações elevadas (250 g/mL), mas nenhum dano ao DNA foi observado no ensaio de micronúcleo. Todos os extratos foram tóxicos para os náuplios de microcrustáceos em pelo menos uma das concentrações usadas (0,01 1000 g/mL), e a LC50 pode ser determinada apenas para os extratos hexano, diclorometano e acetato de etila.

Marcadores Inserção/Deleção (Indel): estudo de ancestralidade e identificação humana na população brasileira

Os polimorfismos denominados Indels são variações de comprimento geradas por inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência de DNA. Estes marcadores genéticos vêm apresentando um grande potencial para fins forenses e populacionais por combinar características dos marcadores SNPs, tais como a capacidade de analisar fragmentos curtos (menores que 250pb) e baixas taxas de mutação, com a facilidade da genotipagem dos STR em uma única PCR, seguida de detecção dos fragmentos amplificados por eletroforese. Com o objetivo de avaliar a eficiência dos Indels em aplicações forenses e esclarecer os detalhes da formação de diferentes populações brasileiras através de dados genéticos, amostras populacionais de diferentes estados brasileiros foram genotipadas através de dois sistemas multiplex. O primeiro (indelplex-HID) foi otimizado para fins de Identificação Humana (HID) e inclui um grupo de 38 marcadores Indels selecionados por apresentarem altos valores de diversidade genética dentro das principais populações continentais. Já o segundo (46-AI-indels), foi selecionado para estudos de ancestralidade e é composto por um conjunto de 46 marcadores informativos de ancestralidade (AIMs). Nesse último caso, ao contrário do anterior, o sistema multiplex inclui marcadores com alta divergência nas frequências alélicas entre populações continentais. Na primeira etapa, o multiplex HID foi aplicado em uma amostra populacional do Rio de Janeiro e em uma amostra populacional dos índios Terena. Um banco de dados de frequências alélicas foi construído para essas duas amostras populacionais. Os valores das frequências alélicas foram utilizados nas comparações estatísticas e parâmetros de vínculos genéticos e forenses foram calculados. O Poder de Discriminação acumulado na população do Rio de Janeiro para os 38 loci testados foi de 0,9999999999999990 e na população dos índios Terena de 0,9999999999997, validando o uso desse sistema numa população heterogênea como a brasileira. A eficiência do indelplex-HID também mostrou-se elevada nas amostras de casos forenses comprometidas, apresentando melhor resultados que marcadores STR em termos de número de loci genotipados e de qualidade de amplificação. Na segunda etapa, o multiplex 46-AI-indels foi aplicado com objetivo de avaliar a ancestralidade em amostras de diferentes estados do Brasil por permitir a identificação de diferenças entre frequências alélicas de grupos populacionais separados geograficamente. A maioria das populações analisadas apresentou elevada herança européia. As populações do Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Amazonas, Alagoas, Minas Gerais e São Paulo apresentaram cerca de 50% de ancestralidade européia, enquanto que nas populações que formam o sul do país e o Espírito Santo este percentual girou em torno de 70%. De uma maneira geral, as contribuições ameríndias e africanas variaram um pouco de acordo com a região. As amostras de Santa Isabel do Rio Negro e dos índios Terena (amostras indicadas como ameríndio-descendentes) de fato mostraram majoritariamente ancestralidade ameríndia (>70%). Os resultados obtidos indicaram que os dados gerados a partir da tipagem dos AIMs estão em estreita concordância com os registros históricos e com outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira e os loci do sistema HID evidenciaram que os são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco.

Caracterização molecular de bastonetes Gram positivos irregulares e actinomicetos aeróbios obtidos de espécimes clínicos, de ensaios de esterilidade e de áreas limpas

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto.

Análise de uma heme oxigenase funcional em Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo

Estudo da ancestralidade materna da população do Rio de Janeiro: análise do DNA mitocondrial

As porções uniparentais do genoma humano, representadas pelo cromossomo Y e pelo DNA mitocondrial (DNAmt), contêm informação genética relacionada às heranças patrilinear e matrilinear, respectivamente. Além da aplicabilidade em genética médica e forense, o DNAmt tem sido utilizado como um importante marcador molecular em estudos sobre evolução para traçar inferências filogenéticas e filogeográficas sobre as populações humanas. A análise de linhagens de DNAmt presentes em diferentes populações mundiais levou à identificação de haplogrupos reunindo diversos haplótipos específicos dos grandes grupos étnicos: africanos, europeus, asiáticos e nativos americanos. A população brasileira é conhecida como uma das mais heterogêneas do mundo, resultado do processo de colonização do país, abrangendo mais de cinco séculos de miscigenação entre povos de diferentes continentes. Este trabalho teve como objetivo estimar a partir da análise do DNA mitocondrial as proporções ancestrais africanas, européias e ameríndias na população do Rio de Janeiro. Para isso foram sequencidas as regiões hipervariáveis HVI e HVII do DNAmt de 109 indivíduos não relacionados geneticamente residentes no Rio de Janeiro. Os haplogrupos foram classificados de acordo com o conjunto de polimorfismos dos haplótipos individuais. Programas estatísticas foram utilizados para a determinação de parâmetros de diversidade genética e comparações populacionais. A diversidade haplotípica foi estimada em 0,9988. Nossos resultados demonstraram na população do Rio de Janeiro percentuais de cerca de 60%, 25% e 15% de ancestralidades maternas africana, ameríndia e européia, respectivamente. Através da análise de distâncias genéticas, evidenciou-se que a população do Rio de Janeiro está mais próxima das populações brasilerias dos estados de São Paulo e Alagoas. Como descrito nos registros históricos, algumas regiões do país tiveram processos de colonização muito específicos que se refletem nas proporções ancestrais maternas e paternas observadas. Em relação ao DNAmt, não se verificou diferença genética significativa entre as populações do Rio de Janeiro e a de Angola, uma população africana. Os resultados obtidos estão em estreita concordância com os registros históricos e outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira

Sequência descritiva: da análise de livros didáticos de língua portuguesa do ensino médio a uma proposta para uma sequência didática produtiva

Este trabalho propõe a revisão crítica da abordagem do ensino da descrição nos livros didáticos de Língua Portuguesa indicados para o Ensino Médio, aprovados pelo Programa Nacional de Livro Didático (PNLD-2012). A fundamentação teórica que respalda este estudo é a teoria das sequências textuais do linguista Jean-Michel Adam. O estudo se justifica, pois, sabe-se que os gêneros textuais são o foco do ensino do texto. Segundo os Parâmetros Curriculares Nacionais (PCN), é de fundamental importância estudar as sequências textuais que estruturam esses gêneros e, em especial, a descritiva, pois ela, além de estar presente em vários gêneros, exerce um papel fundamental no texto, sendo uma estratégia de argumentatividade e um elemento essencial na construção do sentido do texto. Sendo assim, este trabalho pretende contribuir para um campo pouco investigado, o ensino da descrição em livros didáticos de Ensino Médio, apresentando propostas de exercícios sobre o ensino da sequência descritiva para alguns livros analisados no corpus e sugerindo atividades para um livro de Ensino Médio, avançando, assim, na reflexão de uma prática pedagógica que propicie uma maior competência de leitura e escrita aos discentes

Análise da variabilidade gênica de antígenos de T. cruzi com aplicação para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhões de pessoas estão infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na América Latina. Testes tradicionais de diagnóstico estão sendo gradualmente substituídos por métodos inovadores. A utilização de antígenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e várias combinações foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clínicas de diferentes regiões da América Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade genética dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antígenos comumente utilizados em diagnóstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonômicos e de diferentes regiões foram analisadas para avaliar o impacto da variação antigênica em testes de diagnóstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com epítopos de outros agentes patogênicos deve permitir a concepção de melhores testes rápidos. Num primeiro passo, DNA genômico foi extraído das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificação dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antígenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expressão e detecção dos antígenos recombinantes. Na etapa final, análises de estruturas secundárias e terciárias, a última apenas para o antígeno 1F8, visualizaram as diferenças nas sequências de aminoácidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antígeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequência de aminoácidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antigênico desta proteína em todos os tripanosomatídeos que apresentaram alta similaridade com o antígeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presença de epítopos específicos de T. cruzi. O antígeno 1F8 pode ser uma ferramenta útil no diagnóstico da doença de Chagas e que será necessário aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antigênicos para futuramente elaborar poli-epítopos sintéticos adaptados de um maior número possível de antígenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnóstico sorológico e de teste rápido da doença de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimização de antígenos recombinantes para o diagnóstico da doença de Chagas.

Análise de marcadores moleculares do DNA mitocondrial em anuros da Mata Atlântica

A Mata Atlântica brasileira concentra uma das maiores diversidades biológicas da Terra com cerca de 7% das espécies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espécies de anuros do Brasil (c.a. 500 espécies), mas sofre intensa perda e fragmentação de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlântica, a Reserva Ecológica de Guapiaçu (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espécies já descritas. Acredita-se, porém, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificação de espécies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte à identificação morfológica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, são utilizados para a realização de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificação molecular de espécies (DNA barcode) na comunidade de anfíbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivíduos, entre adultos e girinos de 23 espécies, agrupados em seis famílias distintas. Desses 99 indivíduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referência e foram realizadas, com sucesso, a determinação de espécies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espécies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificações haviam sido determinadas com base em critérios morfológicos, agruparam em clados de mesmo gênero, porém de espécies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Além de altos valores de distância intraespecífica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distâncias interespecíficas nulas (0%) temos a indicação de possíveis equívocos em determinações de espécies feitas exclusivamente por critérios morfológicos. Nesse caso, as discordâncias morfológica e molecular são exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificação morfológica e a escassez de chaves de identificação dessas espécies em estágio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificação de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivíduos em estágios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificação morfológica, suporta a correta identificação das espécies de anfíbios anuros.

A técnica da reação em cadeia de polimerase para diagnóstico de tuberculose : meta-análise de estudos publicados

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa causada pelo complexo Mycobacteruim tuberculosis. A melhor forma de prevenção se baseia na detecção e na cura dos casos. Um diagnóstico acurado de TB seria essencial para a identificação e tratamento dos pacientes. O diagnóstico laboratorial recomendado baseia-se na baciloscopia e na cultura de material clínico. Novos métodos, os quais empregam técnica genética baseada na amplificação e detecção do DNA bacteriano ou do RNA, visam melhorar a velocidade, sensibilidade e especificidade da detecção da bactéria. O principal teste desse grupo é o método da reação da cadeia da polimerase (PCR). Entretanto, há discordância na literatura quanto as dados de validade da PCR aplicada ao diagnóstico de tuberculose. O presente estudo realizou uma meta-análise sobre o teste da PCR no diagnóstico de TB. O método estatístico usado estimou efeitos do teste entre os estudos primários. A sensibilidade e a especificidade foram calculadas de acordo com as suas definições: Sensibilidade = TPR, taxa de verdadeiros positivos e Especificidade = 1 FPR, onde FPR = taxa de falsos positivos. Calculamos os logit de TPR e FPR a soma e suas diferenças e fizemos uma back transformação aos eixos de TPR vs. FPR com posterior construção da curva SROC (Moses & Shapiro, 1993). A curva SROC representa uma estimativa da medida de acurácia do teste índice a qual é ajustada pelo ponto de corte tanto quanto pela interdependência dos valores de sensibilidade e especificidade obtidos de cada estudo. Foram localizados 1375 artigos através de busca base de dados do Medline no período de 1988 a 2000. Considerando os critérios de elegibilidade, foram aceitos 111 artigos. A caracterização dos estudos, a validade e a sua aplicabilidade foram apreciadas. A medida combinada de todos os estudos foi de 0,86 para a sensibilidade e 0,95 para a especificidade usando-se o método de efeitos aleatórios. A PCR in-house apresentou melhor performance do que a Amplicor. O AMTD obteve os maiores valores de acurácia possivelmente devido o rRNA apresentar múltiplas cópias por célula. Diante das evidências, a PCR se constitui num teste complementar para tuberculose devendo ter critérios próprios para a sua utilização. No entanto, este teste não contempla os atributos requeridos para a substituição da baciloscopia na rotina diagnóstica.

Análise de polimorfismos e de expressão do gene p16INK4a em neoplasias cervicais

O câncer de colo do útero é o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e um dos cânceres femininos mais incidentes no Brasil. Em lesões pré-malignas e malignas do colo uterino, a proteína p16INK4a, que participa do controle do ciclo celular, apresenta um aumento considerável de sua expressão, devido possivelmente à presença de oncoproteínas do papilomavírus humano (HPV). Dois polimorfismos no gene p16INK4a, p16 500C>G e p16 540C>T, estão localizados na região 3 não traduzida (3UTR), que está envolvida na regulação pós-transcricional da expressão gênica. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis associações entre os polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T e o desenvolvimento de neoplasias cervicais e/ou a severidade das lesões, considerando os níveis de expressão da proteína p16INK4a nas lesões cervicais e certos fatores de risco clássicos para o câncer cervical, incluindo a infecção pelo HPV. Para isso, foram selecionadas 567 mulheres residentes no Rio de Janeiro, 319 com citologia cervical alterada (grupo de casos) e 248 sem história prévia de alteração citológica do colo uterino (grupo de comparação). Amostras de sangue periférico de todas as participantes foram utilizadas na análise molecular dos polimorfismos p16 500C>G e p16 540C>T através da técnica de PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase - polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), usando as enzimas de restrição MspI e HaeIII, respectivamente. A expressão da proteína p16INK4a em 137 biópsias de mulheres pertencentes ao grupo de casos foi avaliada por imunohistoquímica. A detecção de DNA do HPV em células cervicais foi feita em todas as amostras do grupo de comparação e em 194 amostras do grupo de casos pela técnica de PCR, usando dois pares de oligonucleotídeos, MY09/MY11 e GP05+/GP06+. Os dois grupos de estudo se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. As distribuições genotípicas para p16 500C>G e p16 540C>T e as distribuições de combinações haplotípicas nos dois grupos não apresentaram diferenças significativas. A análise do subgrupo HSIL+câncer (casos com lesão intraepitelial de alto grau ou carcinoma invasivo) em comparação com o subgrupo LSIL (casos com lesão intraepitelial de baixo grau) revelou diferença significativa entre as distribuições das combinações haplotípicas (p = 0,036) e diferenças marginais entre as distribuições genotípicas para p16 500C>G (p = 0,071) e p16 540C>T (p = 0,051). O alelo p16 540G, em heterozigose ou homozigose (OR = 1,91, IC 95% = 1,08-3,37), e a combinação haplotípica p16 500C-540C 500G-540C (OR = 2,34, IC 95% = 1,202-4,555) mostraram-se associados com a severidade da lesões cervicais. Já o genótipo p16 540T/T (OR = 0,25, IC 95% = 0,08-0,79), e a combinação haplotípica p16 500C-540T 500C-540T (OR = 0,27, IC 95% = 0,088-0,827) exibiram papel protetor contra o desenvolvimento de lesões mais severas. As análises de interação entre os polimorfismos de p16INK4a e a expressão de p16 ou a infecção pelo HPV foram comprometidas pelo número reduzido de amostras analisadas. Não se observou qualquer interação entre os polimorfismos estudados e os fatores de risco clássicos para o câncer de colo uterino. Nossos resultados apontam para a importância dos polimorfismos do gene p16INK4a como marcadores de severidade da neoplasia cervical.

Metrologia de instrumentos endodônticos por microscopia eletrônica de varredura e análise digital de imagens: uma proposta metodológica

A padronização para a fabricação de instrumentos endodônticos em aço inoxidável contribuiu para o desenvolvimento de novos aspectos geométricos. Surgiram propostas de alterações no desenho da haste helicoidal, da seção reta transversal, da ponta, da conicidade e do diâmetro na extremidade (D0). Concomitantemente, o emprego de ligas em Níquel-Titânio possibilitou a produção de instrumentos acionados a motor, largamente empregados hoje. A cada ano a indústria lança instrumentos com diversas modificações, sem, contudo, disponibilizar informações suficientes quanto às implicações clínicas destas modificações. Existe um crescente interesse no estudo dos diferentes aspectos geométricos e sua precisa metrologia. Tradicionalmente, a aferição de aspectos geométricos de instrumentos endodônticos é realizada visualmente através de microscopia ótica. Entretanto, esse procedimento visual é lento e subjetivo. Este trabalho propõe um novo método para a metrologia de instrumentos endodônticos baseado no microscópio eletrônico de varredura e na análise digital das imagens. A profundidade de campo do MEV permite obter a imagem de todo o relevo do instrumento endodôntico a uma distância de trabalho constante. Além disso, as imagens obtidas pelo detector de elétrons retro-espalhados possuem menos artefatos e sombras, tornando a obtenção e análise das imagens mais fáceis. Adicionalmente a análise das imagens permite formas de mensuração mais eficientes, com maior velocidade e qualidade. Um porta-amostras específico foi adaptado para obtenção das imagens dos instrumentos endodônticos. Ele é composto de um conector elétrico múltiplo com terminais parafusados de 12 pólos com 4 mm de diâmetro, numa base de alumínio coberta por discos de ouro. Os nichos do conector (terminais fêmeas) têm diâmetro apropriado (2,5 mm) para o encaixe dos instrumentos endodônticos. Outrossim, o posicionamento ordenado dos referidos instrumentos no conector elétrico permite a aquisição automatizada das imagens no MEV. Os alvos de ouro produzem, nas imagens de elétrons retro-espalhados, melhor contraste de número atômico entre o fundo em ouro e os instrumentos. No porta-amostras desenvolvido, os discos que compõem o fundo em ouro são na verdade, alvos do aparelho metalizador, comumente encontrados em laboratórios de MEV. Para cada instrumento, imagens de quatro a seis campos adjacentes de 100X de aumento são automaticamente obtidas para cobrir todo o comprimento do instrumento com a magnificação e resolução requeridas (3,12 m/pixel). As imagens obtidas são processadas e analisadas pelos programas Axiovision e KS400. Primeiro elas são dispostas num campo único estendido de cada instrumento por um procedimento de alinhamento semi-automático baseado na inter-relação com o Axiovision. Então a imagem de cada instrumento passa por uma rotina automatizada de análise de imagens no KS400. A rotina segue uma sequência padrão: pré-processamento, segmentação, pós-processamento e mensuração dos aspectos geométricos.

A influência da linguagem para o raciocínio de crenças falsas em Teoria da Mente: uma análise em pacientes afásicos agramáticos

O termo Teoria da Mente diz respeito à habilidade que os seres humanos adquirem de compreender seus próprios estados mentais e os dos outros e predizer ações e comportamentos dentro de uma interação social. As principais questões da pesquisa em Teoria da Mente são: determinar qual o tipo de conhecimento que sustenta essa habilidade, qual sua origem e desenvolvimento e em que momento se manifesta. (Astington e Gopnik, 1991). Ao levar em consideração que a língua pode ser vista como instrumento da cognição (Spelke, 2003), através da qual o falante adquire suporte para o planejamento de ações, contribuindo para o desempenho de tarefas cognitivas complexas (Corrêa, 2006), de Villiers (2004, 2005, 2007 e subsequentes), no que diz respeito à Teoria da Mente, argumenta que o seu desenvolvimento depende do desenvolvimento linguístico, estando diretamente ligado à aquisição de verbos de estado mental, como pensar, por exemplo, pelo fato de que esses verbos subcategorizam uma sentença encaixada. Para ela, o domínio dessa estrutura possibilita que o raciocínio de crenças falsas da Teoria da Mente seja efetivamente realizado. A presente dissertação tem como objetivo verificar em que medida há uma influência direta e necessária da linguagem para a condução de tarefas de Teoria da Mente. Para tanto, focamos nossa atenção em pessoas que estão, por algum motivo, destituídas parcialmente da capacidade linguística, mas que mantêm intacta a capacidade cognitiva, os afásicos. Por meio de uma pesquisa realizada com dois pacientes afásicos de Broca, selecionados pelos critérios clássicos, procuramos entender se a habilidade de predizer ações está intacta nestes pacientes ou se tal habilidade foi perdida, assim como a linguagem. Para tanto, aplicamos dois testes de crença falsa em Teoria da Mente. O primeiro utilizou-se de suporte verbal, uma narração de eventos e expectativas dos personagens envolvidos. A pergunta-teste foi manipulada em função do grau de complexidade por meio do cruzamento de dois fatores: sentenças simples ou complexas e QU-in situ ou movido. O segundo teste seguiu o padrão não-verbal, sendo constituído de uma sequência de imagens, sendo que o sujeito deveria decidir entre duas últimas imagens apresentadas, aquela que coerentemente finalizava a história. Uma vez que houvesse influência direta da linguagem na condução de tarefas de Teoria da Mente, esperar-se-ia que a dificuldade no teste verbal refletisse o grau de complexidade das questões apresentadas. Adicionalmente, o desempenho no teste não-verbal também deveria ser insatisfatório, dado o comprometimento linguístico apresentado pelos sujeitos testados. Para o primeiro teste, o desempenho dos pacientes foi aleatório e inferior ao do grupo controle, já para o segundo teste, o aproveitamento foi de 100%. Em geral, os resultados sugerem que o raciocínio de crenças falsas em Teoria da Mente é alcançado por esses sujeitos, haja vista o desempenho plenamente satisfatório no teste não-verbal. Os resultados do teste verbal, por outro lado, atestam tão somente a dificuldade linguística característica dessa população. Desse modo, conclui-se que uma vez desenvolvida a habilidade em Teoria da Mente, esta permanece intacta na mente destes pacientes, mesmo que destituídos parcialmente da capacidade linguística

Caracterização de alterações epigenéticas no gene JARID1C e desequilíbrios genéticos como causas do retardo mental ligado ao x de etiologia idiopática

O retardo mental (RM) é caracterizado por um funcionamento intelectual significantemente abaixo da média (QI<70). A prevalência de RM varia entre estudos epidemiológicos, sendo estimada em 2-3% da população mundial, constituindo assim, um dos mais importantes problemas de saúde pública. Há um consenso geral de que o RM é mais comum no sexo masculino, um achado atribuído às numerosas mutações nos genes encontrados no cromossomo X, levando ao retardo mental ligado ao X (RMLX). Dentre os genes presentes no cromossomo X, o Jumonji AT-rich interactive domain IC (JARID1C) foi recentemente identificado como um potencial candidato etiológico do RM, quando mutado. O JARID1C codifica uma proteína que atua como uma desmetilase da lisina 4 da histona H3 (H3K4), imprescindível para a regulação epigenética. Tão recente como a identificação do gene JARID1C, é a descoberta de que mudanças no número de cópias de sequências de DNA, caracterizadas por microdeleções e microduplicações, poderiam ser consideradas como razões funcionalmente importantes de RMLX. Atualmente, cerca de 5-10% dos casos de RM em homens são reconhecidos por ocorrerem devido a estas variações do número de cópias no cromossomo X. Neste estudo, investigamos mutações no gene JARID1C, através do rastreamento dos éxons 9, 11, 12, 13, 15 e 16, em 121 homens de famílias com RM provavelmente ligado ao X. Paralelamente, realizamos a análise da variação do número de cópias em 16 genes localizados no cromossomo X através da técnica de MLPA no mesmo grupo de pacientes. Esta metodologia consiste em uma amplificação múltipla que detecta variações no número de cópias de até 50 sequências diferentes de DNA genômico, sendo capaz de distinguir sequências que diferem em apenas um nucleotídeo. O DNA genômico foi extraído a partir de sangue periférico e as amostras foram amplificadas pela técnica de PCR, seguida da análise por sequenciamento direto. Foram identificadas três variantes na sequência do gene JARID1C entre os pacientes analisados: a variante intrônica 2243+11 G>T, que esteve presente em 67% dos pacientes, a variante silenciosa c.1794C>G e a mutação inédita nonsense c.2172C>A, ambas presentes em 0,82% dos indivíduos investigados. A análise através do MLPA revelou uma duplicação em um dos pacientes envolvendo as sondas referentes ao gene GDI1 e ao gene HUWE1. Este trabalho expande o estudo de mutações no gene JARID1C para a população brasileira ereforça a importância da triagem de mutações neste gene em homens portadores de RM familiar de origem idiopática, assim como, é primeiro relato científico relativo à investigação de variações no número de cópias de genes localizados no cromossomo X em homens brasileiros com RM, através da técnica de MLPA.